近日，浙江農(nóng)林大學(xué)桂金山教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際知名期刊《Plant Communications》上發(fā)表了題為“Streamlined multiplex CRISPR editing of receptor-like kinases inPopulusvia cell suspension transformation”（《通過(guò)細(xì)胞懸浮系轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)楊樹(shù)受體激酶的高效多重CRISPR編輯》）的研究論文。該研究成功建立了一種基于葉片直接誘導(dǎo)懸浮細(xì)胞的高效CRISPR基因編輯平臺(tái)，突破楊樹(shù)高通量多基因編輯的技術(shù)瓶頸，實(shí)現(xiàn)了受體激酶（RLKs）大規(guī)模突變體庫(kù)的快速構(gòu)建，為林木功能基因組學(xué)研究和分子育種提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。
植物受體激酶（RLKs）是一類(lèi)重要的膜蛋白，包含胞外域、跨膜域和胞內(nèi)激酶域，參與調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程。在楊樹(shù)中，近200個(gè)RLK基因在木質(zhì)部高表達(dá)，暗示其在木材形成中可能起重要作用。然而，由于該家族基因高度冗余，加之傳統(tǒng)遺傳轉(zhuǎn)化方法效率低、周期長(zhǎng)，多年來(lái)系統(tǒng)研究進(jìn)展緩慢。該團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地開(kāi)發(fā)出一套由楊樹(shù)葉片直接誘導(dǎo)懸浮細(xì)胞的新型培養(yǎng)體系，有效克服了傳統(tǒng)懸浮細(xì)胞和葉盤(pán)/莖段轉(zhuǎn)化中的多個(gè)技術(shù)局限，極大提高了轉(zhuǎn)化效率和通量。基于這一系統(tǒng)，團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了52個(gè)多重CRISPR/Cas9編輯載體，4個(gè)載體一組，每個(gè)載體攜帶4個(gè)sgRNA表達(dá)單元。通過(guò)混合載體轉(zhuǎn)化策略，在T0代獲得4093株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，覆蓋182個(gè)RLK基因，編輯效率72.3%，其中純合編輯效率達(dá)37.3%。該系統(tǒng)成功創(chuàng)制了從單基因到五基因突變的不同組合類(lèi)型突變體，為解析冗余基因功能提供了關(guān)鍵材料。研究進(jìn)一步對(duì)REX1、REX2、REX3三個(gè)旁系同源基因的單突、雙突和三突進(jìn)行表型鑒定，僅發(fā)現(xiàn)三突植株表型明顯，如植株矮化、導(dǎo)管塌陷等，表明這些基因在楊樹(shù)木質(zhì)部發(fā)育中存在功能冗余。該研究首次將懸浮細(xì)胞培養(yǎng)與混合載體文庫(kù)轉(zhuǎn)化技術(shù)相結(jié)合，建立了適用于林木的高通量多基因編輯平臺(tái)，不僅極大提升了基因功能研究的效率，也為楊樹(shù)分子設(shè)計(jì)育種開(kāi)辟了新途徑。
浙江農(nóng)林大學(xué)碩士研究生羅劍波、張穎、龔子劍與中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心曹樹(shù)民博士為論文共同第一作者，桂金山教授為通訊作者。該研究獲國(guó)家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年基金、科技創(chuàng)新2030-重大項(xiàng)目和浙江農(nóng)林大學(xué)科研啟動(dòng)基金等項(xiàng)目資助。
（林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 桂金山）
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